免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。
　　
　　直接法
　　
　　將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
　　
　　間接法
　　
　　如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（*抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為*抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
　　
　　標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。
　　
　　常用于免疫熒光組織化學(xué)染色的熒光素有：異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothioeyanate，TRITC)、四乙基羅丹明(tetraethylrhodamineB200，RB200)、得克薩斯紅(Texasred)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、花青類(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外還有一些新型熒光染料，如量子點(diǎn)。
　　
　　(1)異硫氰酸熒光素(FITC)：FITC性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水和乙醇，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，是檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)zui常用的熒光探針。它還能標(biāo)記抗體，可用于免疫組織化學(xué)單染或多重染色。缺點(diǎn)是在光照下易淬滅，易受自發(fā)熒光影響。zui大激發(fā)光波長(zhǎng)為490nm；zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為525nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光。
　　
　　(2)四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)：該熒光素能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，比FITC穩(wěn)定性好，在生理?xiàng)l件下對(duì)pH值變化不敏感，熒光強(qiáng)度受自發(fā)熒光干擾小。zui大激發(fā)光波長(zhǎng)為550nm；zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)出的黃綠色熒光對(duì)比鮮明，常用于免疫熒光組織化學(xué)雙重染色。
　　
　　(3)四乙基羅丹明(RB200)：能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存，廣泛應(yīng)用于雙標(biāo)記示蹤染色。zui大激發(fā)光波長(zhǎng)為570nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為595-600nm，呈橙紅色熒光。
　　
　　(4)花青類染料：常用的有Cy3、Cy5等，能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。這類染料的熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對(duì)光穩(wěn)定性較強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率較高，對(duì)pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。Cy3zui大激發(fā)光波長(zhǎng)為570nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為650nm，呈綠色熒光。但是，在綠光光譜波長(zhǎng)激發(fā)下，Cy3也可出現(xiàn)紅色熒光。Cy5的zui大激發(fā)光波長(zhǎng)為649nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為680nm，呈紅色熒光。由于Cy5的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為680nm，很難用裸眼觀察，而且不能使用高壓汞燈作為理想的激發(fā)光源，因此，使用普通熒光顯微鏡時(shí)，不推薦使用Cy5。通常觀察Cy5時(shí)需使用激光掃描共聚焦顯微鏡。
　　
　　(5)乙酸甲酯：其本身不發(fā)熒光，但透膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，在酯酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袩晒馓匦缘囊宜峒柞ァＦ浼ぐl(fā)光譜有pH依賴性，是使用zui多的細(xì)胞內(nèi)pH熒光指示劑。zui大激發(fā)光波長(zhǎng)為505nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為530nm，呈綠色熒光。
　　
　　(6)Indo-1：是典型的雙發(fā)射熒光探針。無鈣時(shí)在485nm左右有發(fā)射峰，結(jié)合鈣后，則在405nm處有發(fā)射峰，兩者的比值與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度成線性關(guān)系，將此比值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比即可得出細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，因此，可利用此探針定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。zui大激發(fā)光波長(zhǎng)為330/346nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)熒光。
　　
　　(7)量子點(diǎn)(quantumdot)：是近年來研制的一種新型熒光染料，又稱半導(dǎo)體納米晶體(semiconductornanocrystal)，是由幾百或幾千個(gè)納米級(jí)顆粒構(gòu)成的半導(dǎo)體材料，性質(zhì)穩(wěn)定，溶于水，細(xì)胞本身不能合成和組裝。量子點(diǎn)具有熒光時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)生多種顏色、檢測(cè)方便和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)某一波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)多種大小不同的量子點(diǎn)進(jìn)行照射時(shí)，可以同時(shí)觀察到多種顏色，因而可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)的觀察和檢測(cè)。量子點(diǎn)可與抗體、鏈霉親和素等多種分子進(jìn)行耦聯(lián)，檢測(cè)靶分子的分布和功能。