免疫熒光是指只標記一種蛋白質(zhì)分子,方法比較簡單,只要按照染色步驟去做,通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,固定液選擇的合適與否,可能會直接影響染色結(jié)果。
1、冰凍切片制備:建議用新鮮組織,否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定:切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10 min,尤其要較長時間保存的白片,一定要及時固定和適當保存。
3、血清封閉:為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗來源一致)封閉,減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的,一般10-30 min。
4、一抗孵育條件:在免疫組化反應(yīng)中重要,包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4℃、室溫、37℃,其中4℃效果較佳;孵育時間:這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般37℃1-2 h,而4℃過宿和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45 min。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件:二抗一般室溫或37℃立即觀察,若將標本放在聚乙/烯塑料袋中4℃30 min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。最后,熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長,可能后有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心。
6、復(fù)染:目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復(fù)染。
7、封片:為了長期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。